Aber wie kann BioVariance dieses hohe Tempo erreichen? Und wie funktioniert eigentlich die PCR-Diagnostik? Diese und weitere Informationen zum Workflow im BioVariance Labor erhaltet Ihr im Folgenden.

qPCR-Verfahren im BioVariance Labor

Die Abkürzung „qPCR“ steht für „quantitative Polymerasekettenreaktion“ (engl.: quantitative polymerase chain reaction). SARS-CoV-2 zählt zu den sogenannten RNA-Viren, das heißt das Genom besteht aus RNA und nicht aus DNA wie bei Tieren oder Menschen. Anhand des Genoms kann ein Organismus zweifelsfrei identifiziert werden, was sich die PCR zunutze macht. Vor der eigentlichen PCR wird daher aus der Probe, die sowohl RNA in Form von potenziellen Viren als auch DNA in Form von menschlichen Zellen der Rachenschleimhaut enthält, die RNA isoliert und gereinigt. Diese RNA wird anschließend mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in DNA umgewandelt, da in der PCR nur DNA eingesetzt werden kann.

Danach beginnt die eigentliche PCR: Mithilfe des Enzyms Polymerase werden gezielt charakteristische Abschnitte der enthaltenen DNA vermehrt. Dieser Prozess nennt sich „Amplifikation“. Im Labor der BioVariance trifft dies auf insgesamt 3 Zielsequenzen zu. 2 davon sind Abschnitte von Genen, die in SARS-CoV-2 zu finden sind: das RdRP-Gen und das E-Gen. Das RdRP-Gen kommt spezifisch nur in SARS-CoV-2-Viren vor, das E-Gen hingegen tritt allgemein in der Untergattung der Sarbecoviren auf, wozu auch SARS-CoV-2 gehört. Der Nachweis des RdRP-Gens alleine wäre ausreichend, um die Probe als positiv zu identifizieren. BioVariance setzt jedoch bei der Erstellung eines positiven Befunds den Nachweis beider Virus-Gene voraus, um falsch-positive Ergebnisse zu verhindern. Die dritte Zielsequenz, das RNase-P-Gen, ist ein menschliches Gen und bei jedem Menschen gleichermaßen vorhanden. Es dient der laborinternen Kontrolle, um zu prüfen, ob ausreichend Probenmaterial im Abstrich vorhanden ist, und um somit falsch-negative Ergebnisse zu verhindern.

Auswertung des qPCR-Ergebnisses

Doch wie kann man erkennen, ob eine Amplifikation der Ziel-Sequenzen stattfindet? Während der PCR, die unter Verwendung eines speziellen PCR-Cyclers durchgeführt wird (siehe Abb. 1), werden in die vermehrten DNA-Sequenzen Fluoreszenz-Markierungen eingebracht. Für jede Zielsequenz wird dabei ein anderer Fluoreszenzfarbstoff verwendet. Je mehr DNA die Polymerase produziert, desto stärker ist die Fluoreszenz der Probe in der Echtzeitmessung. Damit ein eindeutiges Testergebnis erstellt werden kann – egal ob positiv oder negativ -, muss in jedem Fall ein ausreichendes Fluoreszenzsignal des menschlichen RNase P-Gens vorliegen. Tritt zusätzlich auch die Fluoreszenz der beiden Virus-Gene auf, ist der Test positiv. Als Maß für die Menge des vorhandenen Zielgens dient dabei der sogenannte Ct-Wert. Er beschreibt die Anzahl der DNA-Vermehrungsschritte, die nötig sind, um das Fluoreszenzsignal eindeutig vom Hintergrundrauschen differenzieren und ein verlässliches Messsignal erzeugen zu können. Je niedriger der Ct-Wert, desto größer ist die Menge des in der Probe vorliegenden Zielgens und damit an Viruspartikeln. Umgekehrt zeigt ein hoher Ct-Wert eine geringe Menge an Virusbestandteilen an. Während der PCR steigt das Fluoreszenzsignal, bis es nach etwa einer Stunde ein Maximum erreicht und abflacht, da die zugegebenen Komponenten zur DNA-Vervielfältigung aufgebraucht wurden. So kommt der typische sigmoidale Kurvenverlauf der Fluoreszenz zustande (siehe Abb. 2).

Doch auch das beste Verfahren ist bestimmten Limitierungen unterworfen. Bei etwa 1 % der Proben kommt es vor, dass das PCR-Ergebnis nicht eindeutig ist, weil beispielsweise nur wenig Probenmaterial vorhanden ist oder das Fluoreszenzsignal der Virus-Gene grenzwertig niedrig ist. In diesen Fällen wird das PCR-Verfahren für diese Probe wiederholt, um ein eindeutiges Ergebnis zu erhalten.

Identifizierung von Virus-Varianten

Das BioVariance Labor unterzieht zudem alle positiven Proben einer sogenannten Varianten-PCR-Analyse zur Identifizierung der jeweiligen SARS-CoV-2-Variante. Zielsequenzen sind dabei mehrere SARS-CoV-2-spezifische Genabschnitte, auf denen die bisher bekannten Mutationen liegen. Diese Analysen zeigten in den letzten Wochen, dass im Landkreis Tirschenreuth das ursprüngliche Virus, der sogenannte Wildtyp, weitestgehend von der erstmals in Großbritannien nachgewiesenen Virus-Variante B.1.1.7, heute auch „Alpha“ genannt, abgelöst wurde. Zusätzlich zur Varianten-PCR werden positive Proben auch zur weiteren Analyse an ein Partnerlabor von BioVariance verschickt, damit auch neue bisher unbekannte Virus-Varianten identifiziert werden können.

Screening der Schulen mittels gepoolter Gurgelproben

Seit Mai 2021 führt das BioVariance Labor zudem das Pooling-Verfahren durch, welches zunächst im Rahmen einer Studie nur die Schulen des Landkreises Tirschenreuth einbezieht. Die Schülerinnen und Schüler müssen dazu keinen Nasen- oder Rachenabstrich vornehmen lassen, sondern lediglich zuhause mit einer kleinen Menge Leitungswasser gurgeln. In der Schule werden diese Gurgel-Proben dann klassenweise „gepoolt“, also in einem gemeinsamen Becher vereint (siehe Abb. 3). Pro Klasse wird somit nur eine PCR-Analyse durchgeführt. Nur wenn ein Pool-Ergebnis positiv ist, werden die Gurgel-Proben der Schülerinnen und Schüler der betroffenen Klasse auch einzeln per PCR getestet. Dieser Prozess ermöglicht eine enorme Einsparung an Laborressourcen bei gleichbleibender Qualität der Ergebnisse.

Qualitätssicherung im BioVariance Labor

Um die Qualität und die Sicherheit der PCR-Analysen zu gewährleisten, stellt sich BioVariance regelmäßig externen Evaluationen. Bei diesen Ringversuchen erhält das Labor mehrere unbekannte Proben von einer zentralen Stelle. Nur wenn all diese Proben korrekt als positiv oder negativ identifiziert werden, besteht das Labor die Prüfung und erhält ein Zertifikat. Im Mai 2021 hat BioVariance die externe Evaluation der European Society for External Quality Assessment (ESfEQA) erneut erfolgreich bestanden.

Außerdem werden die Proben im BioVariance Labor unter sterilen Bedingungen und nach strengen hygienischen Vorgaben bearbeitet, um eine Kontamination des Arbeitsplatzes und eine mögliche Ansteckung der Mitarbeiter zu verhindern (siehe Abb. 4).

Schnelligkeit der PCR-Diagnostik im BioVariance Labor

In der Regel dauert es in Deutschland 24-48 Stunden, bis eine getestete Person ihr Ergebnis erhält. Im BioVariance Labor können die Ergebnisse dagegen in unter 3 Stunden ab dem Zeitpunkt der Probenanlieferung im Labor produziert werden. In 99 % der Fälle erhalten die Testpersonen ihr Ergebnis also noch am selben Tag. Um dieses hohe Tempo zu erreichen setzt BioVariance auf 2 Komponenten: Zum einen verwendet BioVariance für die RNA-Extraktion und die anschließende PCR ein optimiertes Verfahren mit hoher Effizienz, Präzision und Sicherheit. Zum anderen entwickelten die IT-Spezialisten von BioVariance eine eigene Software namens TubeLab zur digitalen Überwachung der Laborprozesse, was die Probenverarbeitung deutlich beschleunigte und vereinfachte. Durch die transparente Nachverfolgung und Dokumentation mit TubeLab erfüllt das Labor höchste Qualitätsansprüche. Übrigens wird schon seit April 2020 auch im Partnerlabor, welches die weitere Sequenzierung der positiven SARS-CoV-2-Proben durchführt, TubeLab zur Überwachung der PCR-Analysen eingesetzt.

Auch personell hat BioVariance aufgestockt und das Labor-Team um 2 technische Laborbeschäftigte sowie 2 studentische Aushilfen aus dem naturwissenschaftlichen Bereich erweitert.

Erfolg der Tirschenreuther Strategie

Mit der Unterstützung des Landratsamtes und des Gesundheitsamtes konnten die bürokratischen Hürden zur Errichtung und Anbindung des Diagnostik-Labors in Waldsassen zum 26.02.2021 innerhalb kürzester Zeit gemeistert werden. Denn für eine schnellstmögliche Testung der Proben sind kurze Wege zwischen Teststation und Labor unabdinglich. Im Optimalfall befinden sich beide Stationen im selben Haus, so wie in Waldsassen. Dank des BRK konnte außerdem ein Testangebot an insgesamt 4 festen und weiteren mobilen Teststationen aufgestellt werden.

Seit der Inbetriebnahme des BioVariance Labors sind dort bereits mehr als 40.000 Rachenabstriche aus dem Landkreis Tirschenreuth per PCR analysiert worden. Mithilfe der hocheffizienten PCR-Diagnostik konnten positive Fälle dabei innerhalb weniger Stunden identifiziert und unter Quarantäne gestellt werden, was sich in den letzten Wochen äußerst positiv auf die Inzidenz vor Ort auswirkte. Zur Zeit der Laboreröffnung im Februar lag die 7-Tages-Inzidenz im Landkreis Tirschenreuth noch bei über 350 positiven Fällen pro 100.000 Einwohner. 15 Wochen später zeigt die Region nun als erster Landkreis in Bayern eine 7-Tages-Inzidenz von 0. Dank der effektiven Zusammenarbeit von Landratsamt, Gesundheitsamt, BRK und Labor sowie des beständigen Durchhaltevermögens der Bevölkerung konnten Neuansteckungen stark reduziert und die hohe Inzidenz im Landkreis Tirschenreuth schließlich bezwungen werden.

Zukünftige Ausrichtung des Labors

Neben der Diagnostik von Infektionskrankheiten will BioVariance die Anwendungsmöglichkeiten des firmeneigenen Labors ausweiten und zukünftig auch die Diagnostik von Krebserkrankungen im Portfolio führen. Die Personalisierung von Krebstherapien soll mithilfe der Sequenzierung von Tumoren und der von BioVariance entwickelten Software OncoVariant weiter vorangetrieben werden. Dieser zukunftsweisende Schritt ermöglicht die Auswahl einer bestmöglichen und individuell zugeschnittenen Therapie für Krebspatienten, um die größtmögliche Wirksamkeit zu erreichen. Zudem plant BioVariance sich die Vorteile der Massenspektrometrie zunutze zu machen, welche beispielsweise die Messung von Stoffwechselprodukten erlaubt.

Ansprechpartner:
Kerstin Hammer

Der Beitrag BioVariance Express-PCR-Labor zwingt Tirschenreuther Inzidenz in die Knie erschien zuerst auf BioVariance - data-driven diagnostics.

Aufgrund der Black Friday Week gibt es gleich noch einen Blogbeitrag. Diesmal geht es um das wohl verrückteste Angebot in dieser Woche – Sequenzierungen zum Schnäppchenpreis – und warum dies – auch in Hinblick auf die personalisierte Medizin – wichtig ist.

Black Friday

Als Black Friday wird in den USA der Freitag nach Thanksgiving bezeichnet, das immer am vierten Donnerstag im November gefeiert wird und den Start in ein traditionelles Familienwochenende und den Beginn der Weihnachtseinkaufsaison markiert. Der Begriff Black Friday wurde erstmals in den 1960er Jahren in den USA verwendet und entstand womöglich durch das an dem Tag vorherrschende Verkehrschaos und die Menschenmassen, die sich wie eine „schwarze Masse“ durch die Straßen zogen. Eine weitere Begriffserklärung könnte man sich an dem Tag geschriebenen schwarzen Zahlen herleiten, die durch die enormen Umsätze jedes Jahr erzielt werden. Hierbei besteht kein Zusammenhang zum in Deutschland bekannten „schwarzen Freitag“ (in den USA bekannt als Black Thursday), der an den Tag des New Yorker Börsencrash von 1929 erinnert.

Apple brachte diesen Brauch 2006 nach Deutschland und wird nun auch hier mit entsprechenden Spar- und Gratisangeboten gefeiert.

Dante Labs

Das wohl interessanteste Angebot, was man diese Woche entdecken kann, kommt von Dante Labs. Diese sind sowohl in Europa, als auch in den USA vertreten und pflegen weltweit Partnerschaften in verschiedene Labore. Die Firma bietet Sequenzierungen des kompletten Genoms in 8 Wochen für nur 850€ an – diesen Freitag anlässlich des Black Fridays sogar für nur 169€!

Genetik

Um nun die enorme Bedeutung dieses Angebotes zu verstehen, gibt es einen kurzen Ein- und Rückblick in die Genetik des Menschen.

Der Mensch besitzt 23 Chromosomen – 22 Autosomen und ein Gonosom, das sogenannte Geschlechtschromosom. Diese enthalten unter anderem die DNS (= Desoxyribonukleinsäure), die als das Molekül des Lebens bezeichnet wird.

Die DNS ist aus Nukleotiden aufgebaut, die wiederum aus einem Phosphat, einem Zucker und einer der vier verfügbaren Basen (Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin) besteht. Die Struktur der DNS wurde 1953 von Watson & Crick entschlüsselt.¹

Somit ist das, was ein Individuum ausmacht und von anderen unterscheidet, allein in der Reihenfolge dieser vier Basen festgelegt. Auf der DNS sind die Gene codiert, die alle notwendigen Informationen für die Entwicklung und das Erscheinungsbild eines Individuums enthalten. Der Mensch besitzt ca. 23.000 Gene. Das scheint viel – auch in Anbetracht der Tatsache, dass wir Menschen die am komplexesten aufgebauten Organismen sind – ist es aber nicht. Caenorhabditis elegans (Fadenwurm) besitzt 19.500 Gene und Arabidopsis thaliana (Acker-Schmalwand), eine Pflanze aus der Familie der Kreuzblütler, hat sogar 27.000 Gene und somit mehr als wir. Seit 2012 ist bekannt, dass sogar eine Banane mehr Gene besitzt – diese hat nämlich stolze 36.500!²

Das menschliche Genom (= die Gesamtheit aller Gene) besteht aus insgesamt 3 Milliarden Basen. Erstaunlich, dass sich die Genome der Menschen zu 99,5% ähneln. Was macht dann die enorme Vielfalt zwischen uns aus? Genau, die restlichen 0,5% – Das sind immerhin 15.000.000 Basen! Beachtlich ist auch die Tatsache, dass unser Genom mit dem eines Schimpansen zu 99,9% ähnlich ist und – um auf das vorherige Beispiel zurückzukommen – zu 50% mit dem einer Banane!³

Durch eine Methode, die sich Sequenzierung nennt, kann man nun diese Abfolge der Basen, den menschlichen Code, lesen und Veränderungen, sogenannte Mutationen, erkennen.

Human Genome Project

Das Human Genome Project,
das im Oktober 1990 gegründet wurde, stellt auf diesem Gebiet eine Revolution dar.⁴ Es war ein internationales Forschungsprojekt mit dem Ziel, ein menschliches Genom vollständig zu entschlüsseln, d.h. die Abfolge der 3 Milliarden Basenpaare in der menschlichen DNS festzustellen.⁵ Die daraus gewonnene Erkenntnis soll Grundlage für die Erforschung vieler biologischer Prozesse, wie Erbkrankheiten oder molekulare Mechanismen zur Krebsentstehung, dienen.⁵ James Watson, der die Struktur der DNS aufgeklärt hat, hat dieses Projekt anfangs geleitet. Insgesamt waren über 1.000 Wissenschaftler aus 40 Ländern beteiligt. Seit April 2003 gilt das menschliche Genom offiziell als vollständig entschlüsselt.⁴ Nachfolgeprojekte wie das 1000 Genome Project haben sich daran angeschlossen. Auch dieses gilt seit Oktober 2012 als beendet – mit mehr als 1.000 entschlüsselten Genomen.

Sequenzierungen

Seitdem hat sich auf diesem Feld viel getan:⁶

Hat es in den 90er Jahren noch knapp acht Jahre gedauert, ein Genom zu sequenzieren, kann man das heute schon in wenigen Tagen. Auch die Anzahl der sequenzierten Genome beläuft sich mittlerweile auf mehrere Tausend.

Das ist in Hinblick auf Medizin und Forschung wichtig. Dadurch können die Mechanismen verschiedener Krankheiten aufgeklärt werden und Behandlungen dementsprechend angepasst werden. Jeder Mensch ist anders – auch in Hinblick auf die Verträglichkeit und Wirksamkeit von Medikamenten. Durch die Informationen, die aus der DNS gewonnen werden können, können Therapien individuell und personalisiert gestaltet werden.

Ein sehr wichtiger Punkt – und nun auch wieder beim einleitenden Thema angekommen – sind die Kosten für Sequenzierungen:⁶

Kostete dies vor ein paar Jahren noch eine Milliarde Dollar, zahlt man mittlerweile nur noch ein paar Tausend. Oder man wartet auf den Black Friday – dann kostet eine Sequenzierung nur $199 (169 €)!

Ansprechpartner:

Kristina Schraml (kristina.schraml@biovariance.com)

Quellen

Der Beitrag Sequenzierungen zum Schnäppchenpreis erschien zuerst auf BioVariance - data-driven diagnostics.